Filter fluoresensi minangka komponen penting ing mikroskop fluoresensi. Sistem khas duwe telung saringan dhasar: saringan eksitasi, saringan emisi lan pangilon dichroic. Biasane dikemas ing kotak supaya klompok kasebut dilebokake ing mikroskop.
Kepiye cara kerja saringan fluoresensi?
Filter Eksitasi
Filter eksitasi ngirimake cahya saka dawa gelombang tartamtu lan mblokir dawa gelombang liyane. Bisa digunakake kanggo ngasilake macem-macem warna kanthi nyetel saringan supaya mung siji warna. Filter eksitasi kasedhiya ing rong jinis utama - saringan long pass lan saringan band pass. Eksitasi biasane saringan bandpass sing mung ngliwati dawa gelombang sing diserap dening fluorophore, saéngga nyuda eksitasi sumber fluoresensi liyane lan ngalangi cahya eksitasi ing pita emisi fluoresensi. Kaya sing dituduhake ing garis biru ing gambar kasebut, BP yaiku 460-495, tegese mung bisa ngliwati fluoresensi 460-495nm.
Iki diselehake ing jalur iluminasi mikroskop fluoresensi lan nyaring kabeh dawa gelombang sumber cahya kajaba jangkoan eksitasi fluorophore. Transmisi minimal panyaring ndhikte padhang lan kecemerlangan gambar. Transmisi minimal 40% kanggo panyaring eksitasi apa wae sing dianjurake supaya transmisi kasebut saenipun> 85%. Bandwidth saka panyaring eksitasi kudu kabeh ana ing jangkoan eksitasi fluorophore supaya dawa gelombang tengah (CWL) panyaring bisa cedhak karo dawa gelombang eksitasi puncak fluorofor. Kapadhetan optik Filter eksitasi (OD) ndhikte pepeteng gambar latar mburi; OD minangka ukuran carane panyaring ngalangi dawa gelombang ing njaba jangkauan transmisi utawa bandwidth. OD minimal 3.0 dianjurake nanging OD 6.0 utawa luwih becik.
Filter emisi
Filter emisi nyedhiyakake tujuan supaya fluoresensi sing dikarepake saka sampel bisa tekan detektor. Padha mblokir dawa gelombang sing luwih cendhek lan nduweni transmisi dhuwur kanggo dawa gelombang sing luwih dawa. Jinis panyaring uga digandhengake karo nomer, contone BA510IF ing gambar (filter penghalang interferensi), sebutan kasebut nuduhake dawa gelombang ing 50% saka transmisi maksimal.
Rekomendasi sing padha kanggo saringan eksitasi tetep bener kanggo saringan emisi: transmisi minimal, bandwidth, OD, lan CWL. Filter emisi kanthi CWL, transmisi minimal, lan kombinasi OD sing cocog nyedhiyakake gambar sing paling padhang, kanthi pamblokiran paling jero, lan njamin deteksi sinyal emisi sing paling samar.
Pangilon Dichroic
Pangilon dichroic diselehake ing antarane panyaring eksitasi lan panyaring emisi kanthi sudut 45 ° lan nggambarake sinyal eksitasi menyang fluorofor nalika ngirim sinyal emisi menyang detektor. Filter-filter dichroic lan beam splitter sing becik duwe transisi sing cetha ing antarane refleksi maksimum lan transmisi maksimal, kanthi refleksi> 95% kanggo bandwidth filter eksitasi lan transmisi> 90% kanggo bandwidth filter emisi. Pilih panyaring kanthi nimbang dawa gelombang persimpangan (λ) saka fluorophore, kanggo nyilikake cahya nyimpang lan nggedhekake rasio sinyal-kanggo-noise gambar fluoresensi.
Pangilon dichroic ing tokoh iki yaiku DM505, dijenengi amarga 505 nanometer minangka dawa gelombang ing 50% saka transmisi maksimum kanggo pangilon iki. Kurva transmisi kanggo pangilon iki nuduhake transmisi dhuwur ing ndhuwur 505 nm, tepak tajem ing transmisi ing sisih kiwa 505 nanometer, lan reflektivitas maksimum ing sisih kiwa 505 nanometer nanging isih ana sawetara transmisi ngisor 505 nm.
Apa bedane saringan pass dawa lan saringan band pass?
Filter fluoresensi bisa dipérang dadi rong jinis: long pass (LP) lan band pass (BP).
Saringan pass dawa ngirimake gelombang dawa lan ngalangi sing luwih cendhek. Dawane gelombang sing dipotong yaiku nilai ing 50% transmisi puncak, lan kabeh dawa gelombang ing ndhuwur potongan kasebut ditularake dening saringan pass dawa. Padha kerep digunakake ing pangilon dichroic lan saringan emisi. Saringan Longpass kudu digunakake nalika aplikasi mbutuhake koleksi emisi maksimum lan nalika diskriminasi spektral ora dikarepake utawa perlu, sing umume kasus kanggo probe sing ngasilake spesies emitting siji ing spesimen kanthi tingkat autofluoresensi latar mburi sing relatif kurang.
Filter pass band mung ngirimake pita dawa gelombang tartamtu, lan mblokir liyane. Dheweke nyuda crosstalk kanthi ngidini mung bagean paling kuat saka spektrum emisi fluorophore sing bisa ditularake, nyuda gangguan autofluoresensi lan kanthi mangkono nambah rasio sinyal-kanggo-noise ing conto autofluoresensi latar mburi dhuwur, sing ora bisa ditawakake saringan pass dawa.
Pira jinis panyaring fluoresensi sing bisa diwenehake BestScope?
Sawetara jinis saringan umum kalebu saringan biru, ijo, lan ultraviolet. Minangka ditampilake ing tabel.
| Filter Set | Filter Eksitasi | Pangilon Dichroic | Filter alangi | Lampu LED Panjang Gelombang | Aplikasi |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485nm | · FITC: Metode antibodi fluoresen · Oranye asam: DNA, RNA · Auramine: basil tuberkel ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535nm | · Rhodamine, TRITC: Metode antibodi fluoresen · Propidium iodide: DNA · RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365nm | · Pengamatan fluoresensi otomatis · DAPI: pewarnaan DNA · Hoechest 332528, 33342: digunakake kanggo pewarnaan Kromosom |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405nm | · Katekolamin · 5-hidroksi triptamin · Tetrasiklin: Skeleton, Gigi |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640nm | · Cy5 ·Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Set Filter sing digunakake ing akuisisi fluoresensi dirancang watara dawa gelombang utama sing digunakake ing aplikasi fluoresensi, sing adhedhasar ing fluorophores sing paling akeh digunakake. Mulane, padha uga dijenengi miturut fluorophore sing dimaksudake kanggo pencitraan, kayata DAPI (biru), FITC (ijo) utawa TRITC (abang) kubus filter.
| Filter Set | Filter Eksitasi | Pangilon Dichroic | Filter alangi | Lampu LED Panjang Gelombang |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535nm |
| FL-Auramine | BP470 | DM480 | BA485 | 450nm |
| Texas Red | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560nm |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560nm |
Kepiye carane milih filter fluoresensi?
1. Prinsip milih panyaring fluoresensi yaiku supaya lampu fluoresensi / emisi ngliwati ujung pencitraan sabisa-bisa, lan mblokir lampu eksitasi kanthi bebarengan, supaya entuk rasio sinyal-kanggo-gangguan sing paling dhuwur. Utamane kanggo aplikasi eksitasi multiphoton lan mikroskop refleksi internal total, gangguan sing ringkih uga bakal nyebabake gangguan gedhe kanggo efek pencitraan, saengga syarat rasio sinyal kanggo gangguan luwih dhuwur.
2. Ngerti spektrum eksitasi lan emisi fluorofor. Kanggo mbangun set panyaring fluoresensi sing ngasilake gambar kontras dhuwur kanthi latar mburi ireng, saringan eksitasi lan emisi kudu entuk transmisi dhuwur kanthi riak passband minimal ing wilayah sing cocog karo puncak eksitasi fluorophore utawa emisi.
3. Coba kekiatan saringan fluoresensi. Filter-filter kasebut kudu kebal karo sumber cahya sing kuat sing ngasilake sinar ultraviolet (UV) sing bisa nyebabake "burnout", utamane filter exciter amarga kena intensitas sumber cahya.
Gambar Sampel Fluoresensi sing Beda
Sumber daya dikumpulake lan diatur ing Internet, lan mung digunakake kanggo sinau lan komunikasi. Yen ana pelanggaran, hubungi kita kanggo mbusak.
Wektu kirim: Dec-09-2022